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      Power Green qPCR Mix (P2101-P2102-P2103-P2104)

      促銷: 480.00~25200.00

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      P2101(1ml) P2102(1mlx5) P2103(1mlx10) P2104(1mlx50) P2105(1ml×100)

      Power Green qPCR Mix

      Cat. #:P2101,P2102,P2103,P2104,P2105

      產品簡介

      Power Green qPCR Mix濃縮的實時定量PCR預混液,使用時隻需加入模板和引物即可進行反應。本品中的DNA聚合酶是新一代類抗體技術修飾的Hotstart Taq DNA聚合酶,在室溫下活性被完全抑製,從而可以在室溫下配置反應液。采用這種熱啟動機製可以顯著提高定量PCR的特異性、擴增效率,得到更廣的可定量擴增區域。本品采用了新的增強劑,對各種目的片段PCR效率的波動可控製在最小範圍內,反複凍融對擴增性能影響極小。本品可與常見定量PCR儀完美兼容,如ABI、Roche、Bio-Rad等。

      產品組成

      Component

      P2101

      P2102

      P2103

      P2104

      P2105

      2X Power Green qPCR Mixa

      1 ml

      1 ml × 5

      1 ml × 10

      1 ml × 50

      1 ml × 100

      超純水

      1 ml

      1 ml × 5

      -

      -

      -

      a.包含SYBR® Green I,Hotstart Taq DNA聚合酶,Aptamer,dNTP及反應緩衝液等。

      保存條件

      Power Green qPCR Mix -20℃避光保存2年,4℃避光可短期保存。

      質量控製

      純度檢測:經質量檢測,產品不含脫氧核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶汙染。

      功能檢測:經不同來源的模板和引物檢測,產品具有優秀的特異性、靈敏性及可重複性等。

      應用舉例

      1. 配製反應體係

      Component

      Volume

      Final   concentration

      DNA template[1]

      0.5-2 μl

      1-4 μl

      Variable

      Forward primer (10 μM)[2]

      0.2 μl

      0.4 μl

      0.2 μM

      Reverse primer (10 μM)

      0.2 μl

      0.4 μl

      0.2 μM

      2X Power Green qPCR Mix[3]

      5 μl

      10 μl

      1X

      ddH2O

      Variable

      Variable

      -

      Total volume[4]

      10 μl

      20 μl

      -

      [1] DNA模板建議用量(10-20 μl體係):1-10 ng cDNA,或10-100 ng gDNA。加樣體積不宜過小,以免造成較大的誤差,但是cDNA的量不宜超過總體積的1/10。因此模板建議濃度(加樣前):cDNA 1-10 ng/μl,gDNA 10-100 ng/μl。

      [2] 引物終濃度建議範圍:0.2-0.6 μM。特異性差時可降低濃度,效率低時可提高濃度。

      [3] 如果熔解曲線出現雜峰,可以減少Mix用量至8 μl20 μl體係);如果對痕量模板的檢出率較低,可以增加Mix用量至12 μl20 μl體係)。

      [4] 建議總體積不小於10 μl,以免造成較大的加樣誤差。具體體積範圍參考儀器說明。

      注意:對於某些固定型號的儀器,需要添加ROX才能精確測定Ct值。ROX會給熔解曲線分析造成一定的背景幹擾。因此,為了避免ROX的雜峰背景幹擾,在應用軟件的“Passive Reference Dye”中不要選擇檢測ROX熒光值選項,然後再進行數據的收集與分析。由於ROX的使用體積較小,建議將ROX提前與qPCR Mix混勻使用。ROX用量參照具體儀器說明,下表僅供參考。

      Instruments

      ROX (100X)

      ABI PRISM 7000/ PRISM   7700/ 7300/ 7900HT/ Step One/ Step One Plus/ GeneAmp 5700

      1-2% (High ROX)

      ABI 7500/ 7500   Fast/ ViiA 7/ QuantStudio 6/7/12K Flex; Agilent Stratagene Mx3000P/ Mx3005P/   Mx4000

      0.2% (Low ROX)

      Bio-Rad CFX96/   CFX384/ iQ/ iQ5; MJ Research Opticon 2/ Chromo 4; Roche LightCycler 480/ 96;   Corbett Rotor Gene G/ Q/ 3000/ 6000; Thermo PikoReal 96; Eppendorf   MasterCycler ep realplex; Cepheid Smart Cycler

      No ROX

      2. 設定反應程序進行qPCR反應

      注:本品含有熱啟動酶,在60℃時會抑製酶活性,因此不建議使用兩步法,推薦使用經典三步法或極速三步法。

      經典三步法程序如下:

      Stage

      Temperature

      Time

      Cycle

      Initial denaturation

      94

      3 min

      1

      Denaturation

      94

      15 sec

      40

      Annealing

      55-65[1]

      15 sec

      Extension

      72

      20 sec

      Dissociation/Melting curve analysisoptional[3]

      本品可用極速三步法快速完成反應,程序如下:

      Stage

      Temperature

      Time

      Cycle

      Initial denaturation

      94℃

      3 min

      1

      Denaturation

      94℃

      5 sec

      40

      Annealing

      55-65℃[1]

      5 sec

      Extension

      72℃

      5-10 sec[2]

      Dissociation/Melting curve analysisoptional[3]

      [1] 最適退火溫度需要摸索。退火溫度一般設定為所用引物的Tm-5℃,若低於55℃,則以Tm值為退火溫度,一般不低於55℃。

      [2] 150 bp以內的擴增子可設置為5 sec;150-300 bp的擴增子可設置為10 sec;300 bp以上的擴增子可適當延長時間。

      [3] 不同儀器熔解曲線采集程序不同,一般按儀器默認熔解曲線采集程序即可。可在延伸(三步法)或退火延伸(兩步法)階段采集信號,也可在反應結束後72 hrs之內采集(避光低溫保存)。

      3. 分析結果

      觀察擴增曲線;調整基線,計算Ct值;觀察熔解曲線檢測特異性;進行相對或絕對定量。

      注意事項

       使用前Mix需要完全解凍,充分混勻。盡量避免多次反複凍融。短期使用可避光保存於4℃。

      ‚ 將(n+x)份反應液混勻後再分注到n個單管中,可降低加樣誤差。(n為重複次數,x為損耗量,一般為n1/10

      ƒ ABI的定量儀器大部分需要ROX校正管間差異,Bio-Rad的定量儀器不需要ROX校正。具體儀器請參照其使用說明。

      „ 輕輕混勻反應液,避免產生氣泡,氣泡會幹擾熒光檢測。可瞬時離心去除氣泡。

      … 引物的特異性、用量以及退火溫度是影響實驗結果的重要因素。務必設計特異性好的引物,隨實驗結果適當調整引物用量(0.05-0.9 μM——特異性較差時減少引物用量,或以3℃為增量提高退火溫度,擴增效率較低時增加引物用量。

      † DNA模板的量應小於500 ng/反應,過高的模板量會引起非特異性擴增。應根據模板類型與基因表達量適當調整用量。

      ‡ 熔解曲線的采集不是必須的,初次使用的引物建議進行熔解曲線采集。熔解曲線可以看出產物的特異性。產物特異性不好的原因有:引物特異性低;退火溫度設置偏低;引物/模板濃度偏高;等。同時,建議通過瓊脂糖凝膠電泳檢測產物的特異性。

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      名稱

      貨號

      規格

      PCR Mix

      P2011/P2012/P2013/P2014/P2015

      1ml/5ml/10ml/50ml/100ml

      Power Green   qPCR Mix

      P2101/P2102/P2103/P2104/P2105

      1ml/5ml/10ml/50ml/100ml

      1kb ladder

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      50/250

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